LAPORAN PRAKTIKUM
PENGANTAR BIOTEKNOLOGI
(PCR, ISOLASI PLASMID DAN ELEKTROFORESIS)
OLEH :
KELOMPOK 11
NAMA :M.ISROK IRAJAB
NIM :B 1 D 010 113
UNIVERSITAS MATARAM
FAKULTAS PETERNAKAN
2011
ACARA I
POLIMERASE CHAIN REAKTION (PCR)
PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.
Polymerase chain reaction ("reaksi [be]rantai polimerase", PCR) merupakan teknik yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel.
PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada organisme hidup, proses PCR hanya dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb (kb=kilo base pairs=1.000 pasang basa). Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen.
Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus temperatur yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas tiga tahapan. Tahapan yang pertama adalah denaturasi cetakan DNA (DNA template) pada temperatur 94-96 °C, yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal. Sesudah itu, dilakukan penurunan temperatur pada tahap kedua sampai 45-60 °C yang memungkinkan terjadinya penempelan (annealing) atau hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA. Primer merupakan oligonukelotida utas tunggal yang sekuens-nya dirancang komplementer dengan ujung fragmen DNA yang ingin disalin; primer menentukan awal dan akhir daerah yang hendak disalin. Tahap yang terakhir adalah tahap ekstensi atau elongasi (elongation), yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase. Temperatur pada tahap ini bergantung pada jenis DNA polimerase yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus PCR akan menggandakan jumlah molekul cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap utas baru yang disintesis akan berperan sebagai cetakan pada siklus selanjutnya.
B. Tujuan dan Manfaat Praktikum
1. Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum yaitu :
• Untuk mengetahui takhnik dan cara melakukan PCR
• Untuk memperbanyak DNA yang diinginkan secara in vitro atau di luar sel.
• Digunakan dalam penelitian biologi seperti mengamati penyakit keturunan, identifikasi sidik jari, kloning DNA dan untuk mengamati kekerabatan antar spesies secara molekuler
2. Manfaat Praktikum
Adapun manfaat dari praktikum yaitu :
• Mahasiswa dapat mengetahui apa itu PCR. Baik dalam pembuatan gel,mengetahui alat-alat dan metode yang digunakan dalam PCR, maupun dalm mengetahui proses dalam melakukan PCR.
MATERI DAN METODE PRAKTIKUM
Materi Praktikum
1. Alat dan Bahan Praktikum.
Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum yaitu :
• Mesin PCR
• Elektroforesis
• Transiluminator sinar UV
• Mikrowave
• Sisir gel
• Mikro pipet
• Tabung ependorf
• Gloves (sarung tangan)
• Parafilm
• Timbangan analatik
Adapun bahan - bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :
• Air steril (SW) : 6,7 µl
• 10 x buffer TAQ : 1 µl
• 2,5 Mm dNTP mix : 0,4 µl
• 10 µM primer foward : 0,4 µl
• 10 µM primer reverse : 0,4 µl
• Template : 1 µl
• Enzim : 0,1 µl
10 µl
Metode Praktikum
Adapun metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :
• Mengambil air steril sebanyak 6,7 µl dan dimasukkan dalam tabung PCR
• Menambahkan 10 x buffre TAQ dan dimasukkan dalam tabung PCR
• Menambahkan 2,5 mM dNTP mix sebanyak 0,4 µl
• Menambahkan 10 µM primer forward sebanyak 0,4 µl
• Menambahkan 10 µM primer reverse sebanyak 0,4 µl
• Menambahkan template 1 µl
• Menambahkan enzim polimerase sebanyak 0,1 µl
• Setelah itu di mix supaya homogen dan dimasukkan dalam mesin PCR yang sebelumnya sudah diatur programnya.
• Hasul PCR tadi dimasukkan dalam elektroforesis
• Menambahkan looding late supaya kelihatan, dan dimasukkan pada masing-masing lubang gel 1 – 4, tunggu selama 10 menit
• Kemudian diamati di transimlator sinar UV.
Tempat dan Tanggal Praktikum
Tempat Praktikum
Adapun tempat praktikum Pengantar Bioteknologi dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi dan Mikrobiologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram.
Tanggal PraktikumAdapun tanggal dilaksanakan praktikum Pengantar Bioteknologi ini pada hari Rabu, 23 November 2011.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Praktikum
Hasil praktikum yang didapatkan dari PCR lubang gel 1-4 terdapat 2 lubang yaitu positif dan negatif. Dimana positif berwarna merah sedangkan yang negatif berwarna biru.
Pembahasan
Reaksi PCR mulai menghasilkan salinan urutan target secara eksponensial. Hanya selama fase eksponensial dari reaksi PCR adalah mungkin untuk ekstrapolasi kembali untuk menentukan kuantitas awal dari urutan target yang terkandung dalam sampel. Karena inhibitor dari reaksi polimerase ditemukan dalam sampel, keterbatasan reagen, akumulasi molekul pirofosfat, dan self-anil dari produk mengumpulkan, reaksi PCR akhirnya berhenti untuk memperkuat urutan target pada tingkat eksponensial dan "dataran tinggi efek" terjadi, membuat titik akhir kuantifikasi produk PCR dapat diandalkan. Ini adalah atribut yang membuat PCR Real-Time RT-PCR kuantitatif sangat diperlukan.
DNA template - sampel DNA yang berisi urutan target. Pada awal reaksi, suhu tinggi diterapkan untuk molekul DNA beruntai ganda yang asli untuk memisahkan alur dari satu sama lain.
DNA polimerase - jenis enzim yang mensintesis untai DNA komplementer baru ke urutan target. Yang pertama dan paling umum digunakan adalah enzim-enzim Taq DNA polimerase (dari aquaticus Thermis), sedangkan PFU DNA polimerase (dari Pyrococcus furiosus) digunakan secara luas karena kesetiaan yang lebih tinggi saat menyalin DNA. Meskipun enzim ini agak berbeda, mereka berdua memiliki dua kemampuan yang membuat mereka cocok untuk PCR:
1) mereka dapat menghasilkan untai DNA baru menggunakan template DNA dan primer,2) mereka tahan terhadap panas
Primer - potongan pendek DNA beruntai tunggal yang melengkapi urutan target. Polimerase dimulai sintesis DNA baru dari ujung primer.
Nukleotida (dNTP atau trifosfat deoksinukleotida) - unit tunggal dari basa A, T, G, dan C, yang pada dasarnya "blok bangunan" untuk untai DNA baru.
RT-PCR (PCR Transkripsi Reverse) yang didahului dengan konversi PCR RNA sampel ke cDNA dengan enzim reverse transcriptase.
Ada beberapa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya PCR, antara lain sebagai berikut :• Pada saat pengambila gel salah
• Pengambilan frimer ataupun reverse tertukar
• Enzim
PENUTUP
Kesimpulan dan Saran
Adapun kesimpulan yang diperoleh yaitu :
• Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA.
• Dari lubang gel PCR 1-4 terdapat 2 lubang yaitu positif dan negatif. Dimana positif berwarna merah sedangkan yang negatif berwarna biru.
• Ada beberpa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya PCR yaitu :pengambilan gel yang salah, pengambilan primer / reverse tertukar , dan enzim.
Saran
Adapun saran yang dapat disampaikan yaitu :
Diharapkan kepada teman-teman praktikan untuk datang tepat pada waktunya dan serius dalam mengikuti praktikum.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim,2011,http://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekular
Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.; Erlich, H. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase".
Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-576-5. Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction
ACARA II DAN III
ISOLASI PLASMID DNA DAN ELEKTROFORESIS GEL
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peneliti yang berkaitan dengan genetika ataupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat dinegara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik).
Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikelpartikel listrik. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan.
C. Tujuan Praktikum
3. Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum yaitu :
• Untuk mengetahui alat-alat yang digunakan dalam proses elektroforesis dan cara penggunaannya.
TINJAUAN PUSTAKA
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: (Soedarmadji, 1996)
1. Ukuran molekul protein Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.
2. Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.
4. Medium penyangga
Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulseperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).
5. Kekuatan voltase
1. Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid
2. Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.
3. Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik).
6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah (Sumitro et al., 1996).
Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsippergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji, 1996).
MATERI DAN METODE PRAKTIKUM
Materi Praktikum
2. Alat dan Bahan Praktikum.Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum yaitu :
• Mikro pipet
• Mesin vortex
• Mesin sentrifugasi (sentrifius)
• Tabung ependorf
• Gloves (sarung tangan)
Adapun bahan - bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :
Larutan I Larutan II Larutan III
50 mM glucose 0.2 N NaOH (harus fresh) 5 M potassium acetate 60 ml
25 Mm Tris-CL (Ph 8.0) 1 % SDS Acetit acid glacial 11.5 ml
10 Mm EDTA (pH 8.0) H2O 28.5 ml
Metode Praktikum
Adapun metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :
• Resusupensikan pellet dengan 100 µl larutan I dingin. Campur merata dengan menggunakan vortex,diulang selama 3x
• Tambahkan 200µl larutan II.Campur dengan merata dengan cara membolak balik tabung dengan cepat beberapa kali (jangan menggunakan vortez!!!)
• Tambahkan 150µl larutan III dingin.Vortex selama beberapa detik kemudian balikkan posisi tabung (inverted)selamam 10 detik. Kembalikan tabung keposisi semula dan simpan dalam es selama 3-5 menit.
• Lakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 5 menit pada suhu 4ºc ,setelah sentrifugasi ,ambil supernatant dan pindahkan ke tabung lain.
• Tambahkan phenol:chloroform dengan perbandingan volume 1:1 dengan jumlah supernatant yang diperoleh ,misalkan volume supernatant yang diperoleh adalah 300 µl.
• Campur dengan merata dengan menggunakan vortex kemudian kemudian lakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 2 menit pada suhu 4ºc.
• Setelah sentrifugasi, ambil supernatant dan pindahkan ke dalam tabung lain.
• Tambahkan etanol (2x volume supernatant ) untuk memperesipitasikan DNA.Campur dengan vortex, kemudian biarkan pada suhu kamar selama 2 menit.
• Lakukan sentrifugasi 12,000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºc.
• Buang supernatant perlahan lahan ,balikkan tabung dan biarkan kering udara selama beberapa menit.
• Bilas DNA pellet dengan ethanol 70% (dingin) kemudian sentrifugasi seperti cara no 9.
• Buang supernatant, balikkan tabung dan biarkan kering udara selama 10 menit.
• Resuspensi DNA dengan 25 µl buffer TE(Ph 8.0)
MATERI DAN METODE
Materi Praktikum
1. Alat yang digunakan Alat yang digunakan dalam elektroforesis yaitu :
• Tabung eppendorf.
• Mikropipet.
• mortar.
• Tabung Erlenmeyer.
• gelas ukur.
• Penangas air (dengan suhu 800C).
• Magnetic stirrer.
• Magnetic bar.
• Sentrifuga, pinset.
• Timbangan.
• Pompa vacuum.
• Cetakan gel 20x16x1 cm3.
• Timer.
• Meja pendingin.
• Pembungkus plastic.
• Freezer.
• Kawat halus.
• Incubator.
• power supply.
• Pisau.
• penggaris.
• Spidol.
• kantong plastik tebal.
2. Bahan yang digunakan
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :
• Saparation gel komponen.
• Acrylamide 30% .
• 4x separation buffer.
• 50% glycerol.
• Air seteril.
• 10% APS/ammonium persulpat.
Metode Praktikum
Metode praktikum kali ini adalah dengan peragaan oleh dosen tentang alatyang digunakan untuk elektrolisis dan cara penggunaanya.
• Siapkan buffer,air seteril.• Semua bahan dicampur dalam 1 campuran.
• Masukkan dalam cetakan.
• Mengambil bahan dan masukkan dalam vacuum
• Mengambil 4x separation buffer ,50%glicerol, air seteril
• Semprotkan dengan pipet kedalam cetakan.
• Tunggu selama 15 menit baru dimasukkan ke 2.
• Masukkan lapisan ke 2.
• Lepas dari penjepit dan ambil sisirnya.
• Masukkan dalam dump yang berisi buffer.
• Menyiapkan sampel .
• Sebelumnya sampel dicampur dalam evendorf kosong , sama 2x sampel buffer tergantung kebutuhan.
• Dan diruning selama 3 jam dan 10 voult baru dikeluarkan.
• Pengecetan peronit setelah dari elektroporesis dengan mengkumasi berlian blue cuci dengan cairan methanol,akuades,asam asetat.
Tempat dan Tanggal Praktikum
Tempat Praktikum
Adapun tempat praktikum Pengantar Bioteknologi dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi dan Mikrobiologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram.
Tanggal Praktikum
Adapun tanggal dilaksanakan praktikum Pengantar Bioteknologi ini pada hari Rabu, 23 November 2011.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Praktikum
Dari pengamatan yang kami lakukan, cara kerja metode elktroforesis adalah sebagai berikut: 1. Pembuatan gel
Cara pembuatan gel adalah dengan melarutkan gel bubuk yang khusus digunakan untuk elktroforesis pada erlenmeyer, kemudian di cetak pada cetakan khusus yang telah disediakan dan ditunggu hingga kering. Dalam pembuatan agar, proporsi campuran antara agar dan pelarutnya harus sesuai, karena kalau tidak maka substratnya tidak akan dapat berjalan .
2. Penempatan sampel
Gel dilepaskan dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan menggunakan pisau. Bagian ujung gel diiris atau dibuat sumuran dengan cetakan khusus kira 2 cm dari salah satu tepi yaitu dari arah katoda yang sebagai penyimpan ekstrak enzim. Ekstar enzim yang akan diuji dikeluarkan dari freezer dan dibiarkan sebentar hingga mencair. Pengambilan ekstrak enzim dilakukan dengan cara mencelupkan kertas saring berukuran 6 x 15 mm ke ekstrak enzim atau dengan pipt mikro. Potongan kertas saring yang telah berisi ekstrak enzim diletakkan dengan posisi tegak lurus ke celah irisan gel. Jarak anatra celah 1-1.5 mm. Sebagai indikator adanya pergerakan maka celah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol.
3. Proses Elektroforesis
Gel yang telah siap kemudian diletakkan secara horizontal diatas kotak elektroforis yang telah berisi larutan penyangga elektroda. Proses ini dilakukan di
dalam lemari pendingin dengan suhu 40C. Kedua sisi gel diberi spons yang telah
dibasahi dengan larutan penyangga elektroda sebagai jembatan anatar larutanpenyangga elektroda dengan gel. Setelah itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut diberi gel yang dingin. Proses elekrofororsis dijalankan dengan memberi daya listrik pada gel. Pemberian daya listrik disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan, misalnya sebesar 50-70 A, 50-60 A atau 45-55 A selama kurang lebih 3 jam. Setelah terlihat bahwa biru brom fenol mencapai titik yang berjarak ± 3 cm dari ujung gel, maka proses elekrofororsis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai
dipotong, sedangkan potongan gel yang menjadi tempat migrasi enzim diiris tipis secara horizontal dengan menggunakan gergaji yang berkawat tipis. Gel diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar gel yang diletakkan dalam wadah plastik, untuk selanjutnya diwarnai sesuia enzim yang akan dianalisis.
4. Visualisasi sistem enzim
Visualisasi sistem dilakukan dengan pewarna biokimia. Dengan komposisi yang telah ditentukan sebelumnya. Atau dapat pula dilakukan dengan pancaran sinar Ultraviolet.
6. Metode Analisis
Dalam hal ini cara menganalisa hasil pita dari elektroforosis tersebut sangat tergantung dari topik apa yang akan diteliti. Hasil visualisasi enzim berupa binti atau noda yang disebut pola pita (bandmorp). Macam pola pita dibedakan atas tipe pola pita yang terbentuk. Semua tipe pola pita yang terbentuk diinterpretasikan sebagai lokus isozim dan alel yang kemudian dijadikan dasar dalam pengukuran parameter yanga da dalam suatu populasi.
KESIMPULAN DAN SARAN
1. Kesimpulan
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul berdasarkan muatannya.
Cara kerja menggunakan metode elktroforesis adalah: 1) Ektraksi enzim, 2) Pembuatan gel, 3) Penempatan sampel, 4) Proses Elektroforesis, 5) Visualisasi sistem enzim dan 6) Metode Analisis.
2. Saran
Saran pada praaktikum kali ini adalah sebaiknya praktikum dilakukan oleh praktikan sendiri dan dilkukan proses elektroforesis yang sebenarnya supaya praktikan lebih mengetahi cara menggunakan metode elektroforesis.
DAFTAR PUSTAKA
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1.
Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta
Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama.Liberty.
Yogyakarta.
Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus
Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA
Universitas Brawijaya. Malang
Zubay, G. L. 1989. Biochemistry 2nd Edition. Mcmillan Publishing Coorporation. New York
Tidak ada komentar:
Posting Komentar