LAPORAN ELEKTROFORESIS PROTEIN

LAPORAN ELEKTROFORESIS PROTEIN

PRAKTIKUM PENGANTAR BIOTEKNOLOGI

OLEH

M.ISRO IROJAB

NIM : B1D 010 113

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS  MATARAM

2011

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang 

      Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama  peneliti  yang  berkaitan  dengan  genetika  ataupun  molecular.  Seiring dengan  kemajuan  zaman  yang  semakin  pesat  dinegara-negara  berkembang  akan selalu  diikuti  pula  dengan  kemajuan  ilmu  pengetahuan  yang  semakin  marak dibidang  teknologi.  Salah  satu  diantaranya  adalah  pengembangan  di  bidang Biologi Molekul. Bidang  ilmu  pengetahuan Bidang Molekuler  ini  telah  dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa  berbagai  kegiatan  penelitian  di  bidang  Kimia,  Biologi  (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik).

     Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik  terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal  ini  termasuk  juga  protein.  Elektroforesis  berasal  dari  bahasa  Yunani  yang mempunyai  arti  transport  atau  perpindahan  melalui  partikelpartikel  listrik. Metode elekroforesis  telah  digunakan  dan  dikembangkan  didalam  teknik  analisa  untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode  tersebut berkembang sangat pesat sekali  di  zaman  kemajuan  teknologi,  disebabkan  karena  pengerjaannya  sangat sederhana  dan  sangat  mudah.  Di  dalam  ilmu  biologi  maupun  biologi  molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan. 

B.    Tujuan dan Manfaat Praktikum

1.    Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari praktikum yaitu :
•    Untuk  mengetahui  alat-alat  yang  digunakan  dalam  proses  elektroforesis dan cara penggunaanya.

TINJAUAN PUSTAKA

Elektroforesis  merupakan  proses  bergeraknya  molekul  bermuatan  pada suatu  medan  listrik.  Kecepatan  molekul  yang  bergerak  pada  medan  listrik tergantung  pada  muatan,  bentuk  dan  ukuran.  Dengan  demikian  elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).Posisi molekul yang  terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,  ataupun  dilakukan  kuantifikasi  dengan  densitometer. Elektroforesis untuk  makromolekul  memerlukan  matriks  penyangga  untuk mencegah  terjadinya difusi  karena  timbulnya  panas  dari  arus  listrik  yang digunakan. Elektroforesis  biasanya  memerlukan  media  penyangga  sebagai  tempat bemigrasinya  molekul-mulekul  biologi.  Media  penyangganya  bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai  dalam  elektroforesis  antara  lain  yaitu  kertas,  selulose,  asetat  dan  gel.  Gel poliakrilamid  dan  agarosa  merupakan  matriks  penyangga  yang  banyak  dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.  Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni:  (Soedarmadji, 1996)

1.    Ukuran molekul protein

Migrasi  molekul  protein  berukuran  besar  lebih  lambat  daripada  migrasi molekul berukuran kecil.

2.    Konsentrasi gel

Migrasi molekul  protein  pada gel  berkosentrasi  rendah  lebih  cepat  daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.

3.    Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena  ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran  listrik  menjadi  maksimal.  Hal  ini  dapat  mempercepat  gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.

4.    Medium penyangga

Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai  migrasi  elektron  atau  penyaringan  berdasarkan  ukuran  molekulseperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).

5.    Kekuatan voltase

•    Jika  ukuran  pori  dari  medium  kira-kira  sama  dengan  molekul,  maka molekul  yang  lebih  kecil  akan  berpindah  lebih  bebas  di  dalam  medan listrik,  sedangkan  molekul  yang  lebih  besar  akan  dibatasi  dalam migrasinya.  Besarnya  pori-pori  dapat  diatur  dengan  mengubah konsentrasi  penyusun  gel  poliakrilamidnya  yaitu  akrilamid  dan bisakrilamid

•    Voltase  yang  dipakai  rendah  (100-500)  V,  kecepatan  migrasi  molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.

•    Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah  serta  jenis  arus  yang  dipakai  selalu  harus  searah  (bukan  bolak balik).

6.    Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi  akan mempercepat  proses  bermigrasinya  protein  dan  sebaliknya  jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin  rendah berat molekulnya maka  semakin  jauh pula protein bergerak  atau mobilitasnya  tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih  besar  akan  bergerak  pada  jarak  yang  lebih  pendek  atau mobilitasnya  rendah (Sumitro et al., 1996).  Hasil  elektroforesis  akan  didapatkan  pita-pita  protein  yang  terpisahkan berdasarkan  berat molekulnya.  Tebal  tipisnya  pita  yang  terbentuk  dari  pita  protein menunjukkan  kandungan  atau  banyaknya  protein  yang  mempunyai  berat  molekul yang  sama  yang  berada  pada posisi  pita  yang  sama. Hal  ini  sejalan  dengan  prinsippergerakan molekul  bermuatan,  yakni molekul  bermuatan  dapat  bergerak  bebas  di bawah pengaruh medan  listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji, 1996).

MATERI DAN METODE PRAKTIKUM

Materi praktikum

1.    Alat dan Bahan Praktikum.
    Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum yaitu :
•    Tabung  eppendorf.
•    Mikropipet.
•    Cetakan gel 20x16x1 cm3.
•    Valcon
•    Meja pendingin
•    Gloves   


2.     Bahan yang digunakan
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :
•    Saparation gel komponen.
•    Acrylamide 30% .
•    4x separation buffer.
•    50% glycerol.
•    Air seteril.
•    10% APS/ammonium persulpat.



Metode Praktikum
Adapaun metode yang digunakam dalam praktikum ini yaitu :
•    Siapkan buffer,air seteril.
•    Semua bahan dicampur dalam 1 campuran.
•    Masukkan dalam cetakan.
•    Mengambil bahan dan masukkan dalam vacuum
•    Mengambil 4x separation buffer ,50%glicerol, air seteril
•    Semprotkan dengan pipet kedalam cetakan.
•    Tunggu selama 15 menit baru dimasukkan ke 2.
•    Masukkan lapisan ke 2.
•    Lepas dari penjepit dan ambil sisirnya.
•    Masukkan dalam dump yang berisi buffer.
•    Menyiapkan sampel .
•    Sebelumnya sampel dicampur dalam evendorf kosong , sama 2x sampel buffer tergantung kebutuhan.
•    Dan diruning selama 3 jam dan 10 voult baru dikeluarkan.

•    Pengecetan peronit setelah dari elektroporesis dengan mengkumasi berlian blue cuci dengan cairan methanol,akuades,asam asetat.

Tempat dan Tanggal Praktikum

Tempat Praktikum

    Adapun tempat praktikum Pengantar Bioteknologi dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi dan Mikrobiologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram.

Tanggal Praktikum
    Adapun tanggal dilaksanakan praktikum Pengantar Bioteknologi  ini pada hari Rabu, 30 November 2011.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Praktikum

Dari hasil praktikum yang dilakukan terdapat

1.    Pembuatan gel

Cara  pembuatan  gel  adalah  dengan  melarutkan  gel  bubuk  yang  khusus digunakan  untuk  elktroforesis  pada  erlenmeyer,  kemudian  di  cetak  pada  cetakan khusus yang telah disediakan dan ditunggu hingga kering.  Dalam pembuatan agar, proporsi campuran antara agar dan pelarutnya harus sesuai, karena kalau tidak maka substratnya tidak akan dapat berjalan .

2.    Penempatan sampel

Gel dilepaskan dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan menggunakan  pisau.  Bagian  ujung  gel  diiris  atau  dibuat  sumuran  dengan  cetakan khusus  kira 2 cm dari salah satu tepi yaitu dari arah katoda yang sebagai penyimpan ekstrak  enzim. Ekstar enzim yang  akan diuji dikeluarkan dari  freezer dan dibiarkan sebentar  hingga  mencair.  Pengambilan  ekstrak  enzim  dilakukan  dengan  cara mencelupkan kertas saring berukuran 6 x 15 mm ke ekstrak enzim atau dengan pipt mikro.  Potongan  kertas  saring  yang  telah  berisi  ekstrak  enzim  diletakkan  dengan posisi tegak lurus ke celah irisan gel. Jarak anatra celah 1-1.5 mm. Sebagai indikator adanya pergerakan maka celah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol.

3.    Proses Elektroforesis

Gel  yang  telah  siap  kemudian  diletakkan  secara  horizontal  diatas  kotak elektroforis  yang  telah  berisi  larutan  penyangga  elektroda.  Proses  ini  dilakukan  di  dalam  lemari  pendingin  dengan  suhu  40C.  Kedua  sisi  gel  diberi  spons  yang  telah  dibasahi  dengan  larutan  penyangga  elektroda  sebagai  jembatan  anatar  larutanpenyangga elektroda dengan gel. Setelah itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut  diberi  gel  yang  dingin.  Proses  elekrofororsis  dijalankan  dengan  memberi daya  listrik  pada  gel. Pemberian  daya  listrik  disesuaikan  dengan  sampel  yang  akan digunakan, misalnya sebesar 50-70  A, 50-60  A atau 45-55  A selama kurang lebih 3  jam. Setelah  terlihat bahwa biru brom  fenol mencapai  titik yang berjarak ± 3  cm dari ujung gel, maka proses elekrofororsis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai  dipotong,  sedangkan  potongan  gel  yang  menjadi  tempat migrasi  enzim  diiris  tipis secara  horizontal  dengan  menggunakan  gergaji  yang  berkawat  tipis.  Gel  diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar gel yang diletakkan dalam wadah plastik, untuk selanjutnya diwarnai sesuia enzim yang akan dianalisis.

4.    Metode Analisis

Dalam hal  ini cara menganalisa hasil pita dari elektroforosis  tersebut  sangat tergantung dari topik apa yang akan diteliti. Hasil visualisasi enzim berupa binti atau noda yang disebut pola pita  (bandmorp). Macam pola pita dibedakan  atas  tipe pola pita  yang  terbentuk.  Semua  tipe  pola  pita  yang  terbentuk  diinterpretasikan  sebagai lokus  isozim  dan  alel  yang  kemudian  dijadikan  dasar  dalam  pengukuran  parameter yanga da dalam suatu populasi. 

PENUTUP

Kesimpulan

Adapun kesimpulan dari praktikum ini yaitu :

Elektroforesis  merupakan  proses  bergeraknya  molekul  bermuatan  pada suatu  medan  listrik.  Kecepatan  molekul  yang  bergerak  pada  medan  listrik tergantung  pada  muatan,  bentuk  dan  ukuran.  Dengan  demikian  elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang  terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,  ataupun  dilakukan  kuantifikasi  dengan  densitometer.

Elektroforesis  untuk  makromolekul  memerlukan  matriks  penyangga  untuk mencegah  terjadinya  difusi  karena  timbulnya  panas  dari  arus  listrik  yang digunakan.  Gel  poliakrilamid  dan  agarosa  merupakan  matriks  penyangga  yang banyak  dipakai  untuk  separasi  protein  dan  asam  nukleat.  Elektroforesis  yang dibahas di bawah  ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida  (PAGE = polyacrilamida  gel  electrophoresis)  untuk  separasi  sampel  protein.  Banyak molekul  biologi  bermuatan  listrik  yang  besarnya  tergantung  pada  pH  dan komposisi medium  dimana molekul  biologi  tersebut  terlarut. Bila  berada  dalam suatu  medan  listrik,  molekul  biologi  yang  bermuatan  positif  akan  bermigrasi keelektroda  negatif  dan  sebaliknya.  Prinsip  inilah  yang  dipakai  dalam  elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul berdasarkan muatannya. 

Saran

Saran pada praktikum kali ini adalah sebaiknya praktikum dilakukan oleh praktikan  sendiri  dan  dilakukan  proses  elektroforesis  yang  sebenarnya  supaya praktikan lebih mengetahi cara menggunakan metode elektroforesis.

DAFTAR PUSTAKA

Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1.   Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta.
Sudarmadji,  S.,  1996.  Teknik  Analisa  Biokimiawi.  Edisi  Pertama.Liberty.Yogyakarta.
Sumitro,  S.  B,  Fatchiyah,  Rahayu,  Widyarti,  dan  Arumningtyas.  1996.  Kursus Teknik-Teknik  Dasar  Analisis  Protein  dan  DNA.  Jurusan  Biologi  FMIPA Universitas Brawijaya. Malang.
Zubay,  G.  L.  1989.  Biochemistry  2nd  Edition. Mcmillan  Publishing  Coorporation.New York