LAPORAN PCR

LAPORAN PCR

PRAKTIKUM PENGANTAR BIOTEKNOLOGI

OLEH

M.ISROK IRAJAB

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS  MATARAM

2011

PENDAHULUAN

  
 Latar belakang

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.

 Polymerase chain reaction ("reaksi [be]rantai polimerase", PCR) merupakan teknik yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel.

PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada organisme hidup, proses PCR hanya dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb (kb=kilo base pairs=1.000 pasang basa). Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen.

Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus temperatur yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas tiga tahapan. Tahapan yang pertama adalah denaturasi cetakan DNA (DNA template) pada temperatur 94-96 °C, yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal. Sesudah itu, dilakukan penurunan temperatur pada tahap kedua sampai 45-60 °C yang memungkinkan terjadinya penempelan (annealing) atau hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA. Primer merupakan oligonukelotida utas tunggal yang sekuens-nya dirancang komplementer dengan ujung fragmen DNA yang ingin disalin; primer menentukan awal dan akhir daerah yang hendak disalin. Tahap yang terakhir adalah tahap ekstensi atau elongasi (elongation), yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase. Temperatur pada tahap ini bergantung pada jenis DNA polimerase yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus PCR akan menggandakan jumlah molekul cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap utas baru yang disintesis akan berperan sebagai cetakan pada siklus selanjutnya.

    Tujuan dan Manfaat Praktikum

    Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari praktikum yaitu :

1. Untuk mengetahui takhnik dan cara melakukan PCR
2. Untuk memperbanyak DNA yang diinginkan secara in vitro atau di luar sel.
3. Digunakan dalam penelitian biologi seperti mengamati penyakit keturunan, identifikasi sidik jari, kloning DNA dan untuk mengamati kekerabatan antar spesies secara molekuler

    Manfaat Praktikum
Adapun manfaat dari praktikum yaitu :

1. Mahasiswa dapat mengetahui apa itu PCR. Baik dalam pembuatan gel,mengetahui alat-alat dan metode yang digunakan dalam PCR, maupun dalm mengetahui proses dalam  melakukan PCR.

MATERI DAN METODE PRAKTIKUM

Materi Praktikum

    Alat dan Bahan Praktikum.
    Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum yaitu :

1.     Mesin PCR
2. Elektroforesis
3. Transiluminator sinar UV
4. Mikrowave
5. Sisir gel
6. Mikro pipet
7. Tabung ependorf
8. Gloves (sarung tangan)
9. Parafilm
10. Timbangan analatik

Adapun bahan - bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :

1.     Air steril                     : 6,7 µl
2. 10 x buffer TAQ            : 1 µl
3. 2,5 Mm dNTP mix        : 0,4 µl
4. 10 µM primer foward    : 0,4 µl
5. 10 µM primer reverse    : 0,4 µl
6. Template                       : 1 µl
7. Enzim                            : (0,1 µl  )/(10 µl)

Metode Praktikum

Adapun metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :

• Mengambil air steril sebanyak  6,7  µl dan dimasukkan dalam tabung PCR
• Menambahkan 10 x buffre TAQ dan dimasukkan dalam tabung  PCR
• Menambahkan 2,5 mM dNTP mix sebanyak 0,4 µl 
• Menambahkan 10 µM primer forward sebanyak 0,4 µl
• Menambahkan 10  µM primer reverse sebanyak 0,4 µl
• Menambahkan template 1 µl
• Menambahkan enzim polimerase sebanyak 0,1 µl
• Setelah itu di mix supaya homogen dan dimasukkan dalam mesin PCR yang sebelumnya sudah diatur programnya.
• Hasul PCR tadi dimasukkan dalam elektroforesis
• Menambahkan  looding late supaya kelihatan, dan dimasukkan pada masing-masing lubang gel 1 – 4, tunggu selama 10 menit
• Kemudian diamati di transimlator sinar UV.

Tempat dan Tanggal Praktikum

Tempat Praktikum

    Adapun tempat praktikum Pengantar Bioteknologi dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi dan Mikrobiologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram.

Tanggal Praktikum

    Adapun tanggal dilaksanakan praktikum Pengantar Bioteknologi  ini pada hari Rabu, 23 November 2011.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Praktikum

     Hasil praktikum yang didapatkan dari PCR lubang gel 1-4 terdapat 2 lubang yaitu positif dan negatif. Dimana positif  berwarna merah sedangkan yang negatif berwarna biru. Seperti yang terlihat pada gambar dibawah ini.

Pembahasan

Reaksi PCR mulai menghasilkan salinan urutan target secara eksponensial. Hanya selama fase eksponensial dari reaksi PCR adalah mungkin untuk ekstrapolasi kembali untuk menentukan kuantitas awal dari urutan target yang terkandung dalam sampel. Karena inhibitor dari reaksi polimerase ditemukan dalam sampel, keterbatasan reagen, akumulasi molekul pirofosfat, dan self-anil dari produk mengumpulkan, reaksi PCR akhirnya berhenti untuk memperkuat urutan target pada tingkat eksponensial dan "dataran tinggi efek" terjadi, membuat titik akhir kuantifikasi produk PCR dapat diandalkan. Ini adalah atribut yang membuat PCR Real-Time RT-PCR kuantitatif sangat diperlukan.

DNA template - sampel DNA yang berisi urutan target. Pada awal reaksi, suhu tinggi diterapkan untuk molekul DNA beruntai ganda yang asli untuk memisahkan alur dari satu sama lain.

            DNA polimerase - jenis enzim yang mensintesis untai DNA komplementer baru ke urutan target. Yang pertama dan paling umum digunakan adalah enzim-enzim Taq DNA polimerase (dari aquaticus Thermis), sedangkan PFU DNA polimerase (dari Pyrococcus furiosus) digunakan secara luas karena kesetiaan yang lebih tinggi saat menyalin DNA. Meskipun enzim ini agak berbeda, mereka berdua memiliki dua kemampuan yang membuat mereka cocok untuk PCR:

    Mereka dapat menghasilkan untai DNA baru menggunakan template DNA dan primer,

    Mereka tahan terhadap panas

Primer - potongan pendek DNA beruntai tunggal yang melengkapi urutan target. Polimerase dimulai sintesis DNA baru dari ujung primer.

Nukleotida (dNTP atau trifosfat deoksinukleotida) - unit tunggal dari basa A, T, G, dan C, yang pada dasarnya "blok bangunan" untuk untai DNA baru.  RT-PCR (PCR Transkripsi Reverse) yang didahului dengan konversi PCR RNA sampel ke cDNA dengan enzim reverse transcriptase.

Ada beberapa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya PCR, antara lain sebagai berikut :

1.     Pada saat pengambila gel salah
2. Pengambilan frimer ataupun reverse tertukar
3. Enzim

PENUTUP

Kesimpulan

Adapun kesimpulan yang  diperoleh yaitu :

    Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA.

    Dari lubang gel PCR 1-4 terdapat 2 lubang yaitu positif dan negatif. Dimana positif  berwarna merah sedangkan yang negatif berwarna biru.

    Ada beberpa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya PCR yaitu :pengambilan gel yang salah, pengambilan primer / reverse tertukar , dan enzim.

Saran

    Adapun saran yang dapat disampaikan yaitu :

Diharapkan kepada teman-teman praktikan untuk datang tepat pada waktunya dan serius dalam mengikuti praktikum.

DAFTAR PUSTAKA