LAPORAN ISOLASI DNA

LAPORAN ISOLASI DNA

PRAKTIKUM PENGANTAR BIOTEKNOLOGI

OLEH

ISRO IROJAB

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS  MATARAM

2011

PENDAHULUAN

A.    Latar Belakang 

Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman – padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara pengumpulan DNA.

Deteksi DNA Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan alat yang dapat menunjang proses isoasi DNA. PCR merupakan teknik untuk mengamplifikasi DNA dalam jumlah kecil melalui proses enzimatik secara in vitro. Penggandaan yang dilakukan PCR bertujuan untuk memperbanyak jumlah DNA agar dalam isolasi dapat diperoleh DNA dalam jumlah besar. Biasanya mesin itu digunakan sebagai amplifkasi DNA mikroorganisme.

melalui elektroforesis dapat dilakukan dengan gel agarose dan gel polyacrilamide. Namun, pada praktikum kali ini menggunakan gel agarose. Karena jumlah DNA yang hanya mencapai 10 ng mampu terdeteksi oleh gel agarose. Proses elektroforesis gagal dilakukan, waktu dan arus yang terlalu tinggi ditengarahi menjadi faktor utama kegagalan tersebut.

B.    Tujuan dan Manfaat Praktikum

1.    Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari praktikum yaitu :

•    Untuk mengetahui cara melakukan isolasi plasmid DNA pada bakteri E-coly

•    Untuk mengetahui cara kerja PCR terhadap amplifikasi DNA.

•    Untuk mengetahui deteksi DNA melalui elektroforesis.

2.    Manfaat Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum yaitu :
•    Mahasiswa dapat mengetahui tekhnik dalam melakukan isolasi plasmid DNA pada bakteri E-coly.

TINJAUAN PUSTAKA

Isolasi plasmid dari bakteri E.coli biasanya disebut dengan istilah Miniprep, kependekan dari Mini-Preparation. Sesuai dengan istilahnya, pekerjaan ini tidak banyak memakan waktu dan tidak pula berat untuk dilakukan. Bakteri E. Coli yang digunakan dalam transformasi gen atau lebih dikenal dengan istilah kloning gen, pada awalnya hanya mempunyai satu macam untaian DNA atau kromosom (kromosom genomik atau kromosom utama). Setelah ditransformasi dengan DNA plasmid rekombinan , maka bakteri tersebut mempunyai dua macam DNA yaitu kromosm genomik dan ekstra kromosom (DNA plasmid) yang mempunyai karakter yang berbeda. Untuk dapat mengisolasi kedua macam DNA tersebut digunakan metode yang berbeda. Dalam praktikum akan diisolasi DNA plasmid dengan mengunakan metode mini prep yaitu metode isolasi plasmid pada skala kecil. DNA rekombinan dibuat dengan cara sebagai berikut : Sepotong DNA dari organisme yang diminati, disambungkan ke dalam atau ke suatu plasmida ataupun pemakan bakteri lamda (disebut wahana atau vektor) dan molekul kimerik yang dihasilkan, masing-masing berturut-turut digunakan untuk mentransformasikan atau menginjeksi sel bakteri inang. Bakteri inang biasanya merupakan suatu galur khas E.coli yang tidak mampu memperbanyak diri tanpa kondisi biakan yang khusus.

Agar sepotong DNA dapat diklonkan untuk penelitian, lebih dahulu DNA itu harus diikat pada suatu wahana kloning atau vektor. Salah satu tipe wahana kloning yang digunakan untuk percobaan ini adalah plasmid. DNA disambungkan pada DNA plasmid dan molekul kimeriknya digunakan untuk mengubah bentuk bakteri inang seperti E. Coli. Kemudian plasmid mengadakan replikasi dalam inang, sewaktu inang tumbuh dan membelah, dan potongan DNA yang diinginkan terklonkan.

Plasmida adalah unsur genetik di luar kromosom (ekstrakromosoma) yang mengadakan replikasi secara autonom di dalam sel bakteri. DNA-nya berbentuk lingkaran dan beruntai ganda. Dan plasmida itu mendukung gen yang diperlukan baik untuk replikasi plasmida maupun untuk fungsi lain. Umumnya wahana plasmida mempunya densitas apungan berlainan daripada DNA inang dan dengan mudah dapat dimurnikan. Beberapa plasmida memiliki beberapa kemampuan untuk berintegrasi ke dalam kromosom inang, dan plasmida ini disebut episom (Widyastuti, 2006).

Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah :

a.    plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi;

b.    DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia;

c.    mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi;

d.    jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;

e.     mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu. (Brock, et al., 1994).

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193).

 Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).

MATERI DAN METODE PRAKTIKUM

Materi Praktikum

1.    Alat dan Bahan Praktikum.
    Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum yaitu :
•    Mikro pipet
•    Mesin vortex
•    Mesin sentrifugasi
•    Tabung ependorf
•    Gloves (sarung tangan)
Adapun bahan - bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :
Larutan I    Larutan II    Larutan III
50 mM glucose    0.2 N NaOH (harus fresh)    5 M potassium acetate 60 ml
25 Mm Tris-CL  (Ph 8.0)    1 % SDS    Acetit acid glacial 11.5 ml
10 Mm EDTA (pH 8.0)    -    H2O 28.5 ml

Persiapan

    Mempersiapkan alat dan bahan
    buat suspensi bakteri dengan cara menumbuhkan satu koloni bakteri pada 2 ml media LB cair.inkubasi selama 18 jam pada incubator dengan btemperatur 37° C
    setlah inkubasi,larutkan sentrifugasi (12,000 rpm)untuk mendapatkan sel-sel bakteri (pellet)

Metode Praktikum

Adapun metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :

•    Resusupensikan pellet dengan 100 µl larutan I dingin. Campur merata dengan menggunakan vortex,diulang selama 3x

•    Tambahkan 200µl larutan II.Campur dengan merata dengan cara membolak balik tabung dengan cepat beberapa kali (jangan menggunakan vortez!!!)

•    Tambahkan 150µl larutan III dingin.Vortex selama beberapa detik kemudian balikkan posisi tabung (inverted)selamam 10 detik. Kembalikan tabung keposisi semula dan simpan dalam es selama 3-5 menit.

•    Lakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 5 menit pada suhu 4ºc ,setelah sentrifugasi ,ambil supernatant dan pindahkan ke tabung lain.

•    Tambahkan phenol:chloroform dengan perbandingan volume 1:1 dengan jumlah supernatant yang diperoleh ,misalkan volume supernatant yang diperoleh adalah 300 µl.

•    Campur dengan merata dengan menggunakan vortex kemudian kemudian lakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 2 menit pada suhu 4ºc.

•    Setelah sentrifugasi, ambil supernatant dan pindahkan ke dalam tabung lain.

•    Tambahkan etanol (2x volume supernatant ) untuk memperesipitasikan DNA.Campur dengan vortex, kemudian biarkan pada suhu kamar selama 2 menit.

•    Lakukan sentrifugasi 12,000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºc.

•    Buang supernatant perlahan lahan ,balikkan tabung dan biarkan kering udara selama beberapa menit.

•    Bilas DNA pellet dengan ethanol 70% (dingin) kemudian sentrifugasi seperti cara no 9.

•    Buang supernatant, balikkan tabung dan biarkan kering udara selama 10 menit.

•    Resuspensi DNA dengan 25 µl buffer TE(Ph 8.0)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Praktikum

Pembahasan

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Plasmid tersebar luas di antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari sekitar 1 kb hingga lebih dari 250 kb (1 kb = 1000 pb). Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat berikut ini:

1.    Mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya,

2.    Mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang,

3.    Mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen dna, dan

4.    Mempunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel inang.

Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.

Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.

Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar (100-200µg) dinamakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 µg.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis.

DNA kromosom dan DNA plasmid dapat merenaturasi dengan membutuhkan lama waktu yang berbeda. Tahapan yang harus dilalui selama proses ini adalah resuspention, lysis, neutralization, dan clearing of lysate. Pada tahap resuspensi, pellet sel hasil dentrifuge diresuspensikan dalam buffer STE (Saline Tris EDTA) pH 8. Adanya EDTA ini berfungsi sebagai pengkelat magnesium kalsium yang berperan dalam menjaga stabilitas membran plasma. Selain itu EDTA juga menghambat DNAse sehingga molekul DNA tidak terdenaturasi. Tris Saline menjaga pH larutan sehingga DNA tetap stabil. Tahap lysis tetap menggunakan pelet hasil sentrifuge pada tahap sebelumnya. Pellet ini diresuspensikan ke dalam buffer lisis yang terdiri dari: SDS 10% untuk menghancurkan membran sel dan denaturasi protein, NaOH untuk mendenaturasi DNA dan mulai menghidrolisis RNA, enzim lisosim menghancurkan dinding sel bakteri, dan larutan glukosa untuk meningkatkan tekanan osmotik di luar sel yang mampu membantu proses pelisisan. DNA plasmid dan DNA kromosomal akan terdenaturasi dengan cara yang berbeda dengan menggunakan NaOH, karena plasmid berbentuk sirkuler maka setelah mengalami denaturasi bentuknya akan tetap utuh. DNA kromosomal yang berbentuk linier akan segera kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi. Selanjutnya adalah tahap neutralizer, dengan menambahkan larutan penetralisir yang berisi kalium asetat dan asam asetat pada pH 5. Kegunaan dari asam asetat adalah untuk menetralkan pH sehingga pH tidak basa dan DNA bisa renaturasi.

Penambahan kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single stranded DNA karena molekulnyayang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam tinggi, pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang. Yang perlu diperhatikan pada tahap ini adalah proses renaturasi pada DNA plasmid lebih cepat daripada renaturasi dari DNA kromosomal. Selain itu pada saat penambahan larutan lisis ini sebaiknya tidak digunakan vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena akan ikut menyebabkan DNA kromosomal menjadi lebih kecil sehingga akan terlarut pada supernatant.

Kemudian masuk ke tahap clearing of lysates, pada tahap ini diperoleh supernatant yang berisi DNA plasmid. Penambahan etanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas, etanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang mengendap. Selanjutnya untuk menghilangkan pengotor yang masih ada ditambahkan etanol 70% sehingga sisa etanol yang tersisa dapat diuapkan dengan evaporasi. Plasmid yang didapatkan berupa pellet dilarutkan kembali dengan ddH2O sehingga dapat dilakukan analisis lebih lanjut dengan menggunakan elektroforesis.

Komponen penting dalam eksperimen kloning gen adalah vektor yang membawa gen masuk sel inang dan bertanggung jawab atas replikasinya. Untuk dapat bertindak sebagai vektor suatu molekul DNA harus mampu memasuki sel inang serta mengadakan replikasi untuk menghasilkan kopi dalam jumlah yang besar. Salah satu vektor penting yang sering digunakan dalam kloning gen adalah plasmid. Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim. Ukuran plasmid berkisar antara 1 kb untuk yang terkecil dan lebih dari 250 kb untuk yang besar. Ukuran kurang dari 10 kb adalah yang terbaik untuk vektor kloning. Jumlah kopi menunjukkan jumlah molekul plasmid masing- masing yang biasanya ditemukan dalam satu sel bakteri, biasanya berkisar antara 1 sampai 50 atau lebih. Vektor kloning perlu ada dalam sel dengan banyak kopi sehingga dapat dihasilkan molekul DNA rekombinan dalam jumlah besar.

Plasmid pUC19 adalah satu dari tujuh buah plasmid yang diketahui berada dalam sel Eschericia coli. Bakteri inang pembawa pUC19 ini ditumbuhkan dalam medium kompleks: Luria Bertani (LB) sebagai sumber DNA.  Dalam medium LB pada suhu 370 C dengan pengocokan pada kecepatan 150-250 r/menit, sel E. coli akan membelah sekali setiap 20 menit sampai kultur mencapai densitas maksimum kira-kira 2-3 x 109 sel/ml.

E. coli JM109 dipanen, diambil 3 ml dan disentrifuse pada kecepatan 5700 x g selama 5 menit. Tujuan dari sentrifugasi ini adalah untuk mengendapkan bakteri pada dasar tabung karena untuk penyiapan ekstrak sel bakteri harus diperoleh dalam volume yang sekecil mungkin.

Setelah didapatkan ekstrak sel, langkah pertama dalam proses isolasi DNA adalah perusakan dan atau pembuangan dinding sel bakteri inang dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Pada praktikum acara ini, perusakan dinding sel dilakukan dengan pemberian STE  sebanyak 1 ml kedalam pelet sel hasil sentrifugasi pertama.

Pemurnian atau isolasi DNA plasmid menggunakan kit QIAprep ini menggunakan metode pemurnian berdasarkan konformasi DNA (dengan denaturasi alkali). Kebanyakan DNA plasmid berada dalam sel sebagai molekul yang sangat berlilitan (supercoiled) atau disebut covalently closed circular (CCC) DNA. DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya. Molekul supercoiled ini jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom dan dapat dipisahkan dengan dua cara yaitu: denaturasi dengan alkali, dan pemurnian berdasarkan kerapatan apung (bouyant density) atau dikenal dengan istilah equilibrium density gradient centrifugation atau sentrifugasi isopiknik.

Langkah berikutnya dalam isolasi DNA adalah lisis sel, dimana pada acara ini digunakan buffer P1 dan P2. Buffer P1 sebelumnya telah ditambah dengan enzim RNAse A dan deterjen Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dan indikator LyseBlue. RNAse dan SDS adalah kombinasi untuk tujuan perusakan dinding dan lisis sel. Pada pH 12 -12,5 ikatan hidrogen dari DNA kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks ganda terurai dan kedua rantai polipeptida memisah. Untuk mengecek apakah denaturasi ini telah berhasil dengan baik atau tidak, maka penambahan P2 akan memperjelas proses ini. Apabila denaturasi telah terjadi, maka suspensi pelet sel akan berwana biru karena adanya reaksi dengan indikator LyseBlue.

Proses re-naturasi selanjutnya dilakukan dengan cara mengembalikan DNA pada kondisi asam yaitu dengan penambahan buffer N3  yang mengandung asam asetat. Pemberian asam akan menyebabkan DNA bakteri yang sebelumnya terdenaturasi, mengelompok dalam massa DNA linier yang kusut. Sentrifugasi selanjutnya pada kecepatan 13000 selama 10 menit akan mengendapkan massa DNA ini di dasar tabung sentrifugasi dan meninggalkan plasmid murni dalam supernatan.

Penambahan RNAse A (ribonuklease) dan SDS di buffer pertama (P1) menyebabkan sebagian besar protein dan RNA menjadi tidak larut dan dapat dihilangkan pada tahap sentrifugasi (ikut mengendap bersama massa DNA, dinding serta debris sel lainnya). Presipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk menghilangkan sisa protein, tidak perlu dilakukan jika kita menggunakan metode denaturasi alkali.

Supernatan berisi plasmid murni kemudian dicuci dua kali menggunakan buffer PB isinya mengandung isopropanol dan buffer PE yang mengandung 96 – 100% ethanol. Dari Qiaprep spin column, supernatan plasmid kemudian dipindahkan ke tabung mikrosentrifuse baru dan di elusi dua kali dengan buffer EB (Elution Buffer) dimana masing- masing melewati sentrifugasi pada 13000 rpm selama satu menit. Hasil elusi inilah DNA plasmid pUC19  yang telah berhasil kita isolasi dari E.coli JM109.

PENUTUP

KESIMPULAN

1.    DNA plasmid merupakan wadah untuk cloning gen serta mempunyai ukuran yang lebih kecil.

2.    Plasmid tersebar luas di antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari sekitar 1 kb hingga lebih dari 250 kb (1 kb = 1000 pb).

3.    DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom

4.    Aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

SARAN

1.    Praktikan lebih teliti dalam mengamati perubahan-perubahan proses dalam plasmid isolasi DNA.
2.    Praktikan lebih berhati-hati dalam melakukan praktikum agar alat-alat praktikum tidak mudah rusak.
3.    Praktikan harus menjaga kesterilan alat-alat praktikum dan menjaga kesterilan tubuh sehingga tidak terkontaminasi dengan mikroba.

DAFTAR PUSTAKA

Calladine, C. R., Horace RD. 2004. Understanding DNA. Amsterdam : Academic Press.
Campbell, N.A. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta : Erlangga.
Muladno, 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda. Bogor.
Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik  Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB