Minggu, 01 April 2012

LAPORAN PRAKTIKUM
PENGANTAR BIOTEKNOLOGI
(PCR, ISOLASI PLASMID DAN ELEKTROFORESIS)


OLEH :
KELOMPOK 11
NAMA    :M.ISROK IRAJAB
   NIM                :B 1 D  010 113 

UNIVERSITAS MATARAM
FAKULTAS PETERNAKAN
2011

ACARA I
POLIMERASE CHAIN REAKTION (PCR)
PENDAHULUAN
A.    Latar belakang
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.
 Polymerase chain reaction ("reaksi [be]rantai polimerase", PCR) merupakan teknik yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel.
PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada organisme hidup, proses PCR hanya dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb (kb=kilo base pairs=1.000 pasang basa). Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen.
Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus temperatur yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas tiga tahapan. Tahapan yang pertama adalah denaturasi cetakan DNA (DNA template) pada temperatur 94-96 °C, yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal. Sesudah itu, dilakukan penurunan temperatur pada tahap kedua sampai 45-60 °C yang memungkinkan terjadinya penempelan (annealing) atau hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA. Primer merupakan oligonukelotida utas tunggal yang sekuens-nya dirancang komplementer dengan ujung fragmen DNA yang ingin disalin; primer menentukan awal dan akhir daerah yang hendak disalin. Tahap yang terakhir adalah tahap ekstensi atau elongasi (elongation), yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase. Temperatur pada tahap ini bergantung pada jenis DNA polimerase yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus PCR akan menggandakan jumlah molekul cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap utas baru yang disintesis akan berperan sebagai cetakan pada siklus selanjutnya.
B.    Tujuan dan Manfaat Praktikum

1.    Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum yaitu :
•    Untuk mengetahui takhnik dan cara melakukan PCR
•    Untuk memperbanyak DNA yang diinginkan secara in vitro atau di luar sel.
•    Digunakan dalam penelitian biologi seperti mengamati penyakit keturunan, identifikasi sidik jari, kloning DNA dan untuk mengamati kekerabatan antar spesies secara molekuler

2.    Manfaat Praktikum
Adapun manfaat dari praktikum yaitu :
•    Mahasiswa dapat mengetahui apa itu PCR. Baik dalam pembuatan gel,mengetahui alat-alat dan metode yang digunakan dalam PCR, maupun dalm mengetahui proses dalam  melakukan PCR.




MATERI DAN METODE PRAKTIKUM
Materi Praktikum

1.    Alat dan Bahan Praktikum.
    Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum yaitu :
•    Mesin PCR
•    Elektroforesis
•    Transiluminator sinar UV
•    Mikrowave
•    Sisir gel
•    Mikro pipet
•    Tabung ependorf
•    Gloves (sarung tangan)
•    Parafilm
•    Timbangan analatik

Adapun bahan - bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :
•    Air steril (SW)        : 6,7 µl
•    10 x buffer TAQ        : 1 µl
•    2,5 Mm dNTP mix        : 0,4 µl
•    10 µM primer foward    : 0,4 µl
•    10 µM primer reverse    : 0,4 µl
•    Template            : 1 µl
•    Enzim             : 0,1 µl
  10 µl




Metode Praktikum

Adapun metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :
•    Mengambil air steril sebanyak  6,7  µl dan dimasukkan dalam tabung PCR
•    Menambahkan 10 x buffre TAQ dan dimasukkan dalam tabung  PCR
•    Menambahkan 2,5 mM dNTP mix sebanyak 0,4 µl 
•    Menambahkan 10 µM primer forward sebanyak 0,4 µl
•    Menambahkan 10  µM primer reverse sebanyak 0,4 µl
•    Menambahkan template 1 µl
•    Menambahkan enzim polimerase sebanyak 0,1 µl
•    Setelah itu di mix supaya homogen dan dimasukkan dalam mesin PCR yang sebelumnya sudah diatur programnya.
•    Hasul PCR tadi dimasukkan dalam elektroforesis
•    Menambahkan  looding late supaya kelihatan, dan dimasukkan pada masing-masing lubang gel 1 – 4, tunggu selama 10 menit
•    Kemudian diamati di transimlator sinar UV.

Tempat dan Tanggal Praktikum

Tempat Praktikum
    Adapun tempat praktikum Pengantar Bioteknologi dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi dan Mikrobiologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram.
Tanggal Praktikum
    Adapun tanggal dilaksanakan praktikum Pengantar Bioteknologi  ini pada hari Rabu, 23 November 2011.



HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Praktikum

     Hasil praktikum yang didapatkan dari PCR lubang gel 1-4 terdapat 2 lubang yaitu positif dan negatif. Dimana positif  berwarna merah sedangkan yang negatif berwarna biru.

Pembahasan

Reaksi PCR mulai menghasilkan salinan urutan target secara eksponensial. Hanya selama fase eksponensial dari reaksi PCR adalah mungkin untuk ekstrapolasi kembali untuk menentukan kuantitas awal dari urutan target yang terkandung dalam sampel. Karena inhibitor dari reaksi polimerase ditemukan dalam sampel, keterbatasan reagen, akumulasi molekul pirofosfat, dan self-anil dari produk mengumpulkan, reaksi PCR akhirnya berhenti untuk memperkuat urutan target pada tingkat eksponensial dan "dataran tinggi efek" terjadi, membuat titik akhir kuantifikasi produk PCR dapat diandalkan. Ini adalah atribut yang membuat PCR Real-Time RT-PCR kuantitatif sangat diperlukan.
DNA template - sampel DNA yang berisi urutan target. Pada awal reaksi, suhu tinggi diterapkan untuk molekul DNA beruntai ganda yang asli untuk memisahkan alur dari satu sama lain.

            DNA polimerase - jenis enzim yang mensintesis untai DNA komplementer baru ke urutan target. Yang pertama dan paling umum digunakan adalah enzim-enzim Taq DNA polimerase (dari aquaticus Thermis), sedangkan PFU DNA polimerase (dari Pyrococcus furiosus) digunakan secara luas karena kesetiaan yang lebih tinggi saat menyalin DNA. Meskipun enzim ini agak berbeda, mereka berdua memiliki dua kemampuan yang membuat mereka cocok untuk PCR:
1)    mereka dapat menghasilkan untai DNA baru menggunakan template DNA dan primer,
2)    mereka tahan terhadap panas
Primer - potongan pendek DNA beruntai tunggal yang melengkapi urutan target. Polimerase dimulai sintesis DNA baru dari ujung primer.

Nukleotida (dNTP atau trifosfat deoksinukleotida) - unit tunggal dari basa A, T, G, dan C, yang pada dasarnya "blok bangunan" untuk untai DNA baru.
RT-PCR (PCR Transkripsi Reverse) yang didahului dengan konversi PCR RNA sampel ke cDNA dengan enzim reverse transcriptase.
Ada beberapa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya PCR, antara lain sebagai berikut :
•    Pada saat pengambila gel salah
•    Pengambilan frimer ataupun reverse tertukar
•    Enzim




PENUTUP
Kesimpulan dan Saran

Adapun kesimpulan yang  diperoleh yaitu :
•    Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA.
•    Dari lubang gel PCR 1-4 terdapat 2 lubang yaitu positif dan negatif. Dimana positif  berwarna merah sedangkan yang negatif berwarna biru.
•    Ada beberpa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya PCR yaitu :pengambilan gel yang salah, pengambilan primer / reverse tertukar , dan enzim.

Saran
    Adapun saran yang dapat disampaikan yaitu :
Diharapkan kepada teman-teman praktikan untuk datang tepat pada waktunya dan serius dalam mengikuti praktikum.



DAFTAR PUSTAKA

      Anonim,2011,http://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekular                  
Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.; Erlich, H. (1988).  "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase".
Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-576-5. Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction



ACARA II DAN III
ISOLASI PLASMID DNA DAN ELEKTROFORESIS GEL
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang 

Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama  peneliti  yang  berkaitan  dengan  genetika  ataupun  molecular.  Seiring dengan  kemajuan  zaman  yang  semakin  pesat  dinegara-negara  berkembang  akan selalu  diikuti  pula  dengan  kemajuan  ilmu  pengetahuan  yang  semakin  marak dibidang  teknologi.  Salah  satu  diantaranya  adalah  pengembangan  di  bidang Biologi Molekul. Bidang  ilmu  pengetahuan Bidang Molekuler  ini  telah  dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa  berbagai  kegiatan  penelitian  di  bidang  Kimia,  Biologi  (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik).
Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik  terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal  ini  termasuk  juga  protein.  Elektroforesis  berasal  dari  bahasa  Yunani  yang mempunyai  arti  transport  atau  perpindahan  melalui  partikelpartikel  listrik. Metode elekroforesis  telah  digunakan  dan  dikembangkan  didalam  teknik  analisa  untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode  tersebut berkembang sangat pesat sekali  di  zaman  kemajuan  teknologi,  disebabkan  karena  pengerjaannya  sangat sederhana  dan  sangat  mudah.  Di  dalam  ilmu  biologi  maupun  biologi  molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan. 

C.    Tujuan Praktikum

3.    Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum yaitu :
•    Untuk  mengetahui  alat-alat  yang  digunakan  dalam  proses  elektroforesis dan cara penggunaannya.

TINJAUAN PUSTAKA

Elektroforesis  merupakan  proses  bergeraknya  molekul  bermuatan  pada suatu  medan  listrik.  Kecepatan  molekul  yang  bergerak  pada  medan  listrik tergantung  pada  muatan,  bentuk  dan  ukuran.  Dengan  demikian  elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).Posisi molekul yang  terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,  ataupun  dilakukan  kuantifikasi  dengan  densitometer.Elektroforesis untuk  makromolekul  memerlukan  matriks  penyangga  untuk mencegah  terjadinya difusi  karena  timbulnya  panas  dari  arus  listrik  yang digunakan.Elektroforesis  biasanya  memerlukan  media  penyangga  sebagai  tempat bemigrasinya  molekul-mulekul  biologi.  Media  penyangganya  bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai  dalam  elektroforesis  antara  lain  yaitu  kertas,  selulose,  asetat  dan  gel.  Gel poliakrilamid  dan  agarosa  merupakan  matriks  penyangga  yang  banyak  dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.  Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni:  (Soedarmadji, 1996)
1.  Ukuran molekul protein
Migrasi  molekul  protein  berukuran  besar  lebih  lambat  daripada  migrasi molekul berukuran kecil.
2.  Konsentrasi gel
Migrasi molekul  protein  pada gel  berkosentrasi  rendah  lebih  cepat  daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
3.  Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena  ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran  listrik  menjadi  maksimal.  Hal  ini  dapat  mempercepat  gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.

4.  Medium penyangga
Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai  migrasi  elektron  atau  penyaringan  berdasarkan  ukuran  molekulseperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).
5.  Kekuatan voltase
1. Jika  ukuran  pori  dari  medium  kira-kira  sama  dengan  molekul,  maka molekul  yang  lebih  kecil  akan  berpindah  lebih  bebas  di  dalam  medan listrik,  sedangkan  molekul  yang  lebih  besar  akan  dibatasi  dalam migrasinya.  Besarnya  pori-pori  dapat  diatur  dengan  mengubah konsentrasi  penyusun  gel  poliakrilamidnya  yaitu  akrilamid  dan bisakrilamid
2.  Voltase  yang  dipakai  rendah  (100-500)  V,  kecepatan  migrasi  molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.
3.  Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah  serta  jenis  arus  yang  dipakai  selalu  harus  searah  (bukan  bolak balik).
6.  Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi  akan mempercepat  proses  bermigrasinya  protein  dan  sebaliknya  jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin  rendah berat molekulnya maka  semakin  jauh pula protein bergerak  atau mobilitasnya  tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih  besar  akan  bergerak  pada  jarak  yang  lebih  pendek  atau mobilitasnya  rendah (Sumitro et al., 1996).

Hasil  elektroforesis  akan  didapatkan  pita-pita  protein  yang  terpisahkan berdasarkan  berat molekulnya.  Tebal  tipisnya  pita  yang  terbentuk  dari  pita  protein menunjukkan  kandungan  atau  banyaknya  protein  yang  mempunyai  berat  molekul yang  sama  yang  berada  pada posisi  pita  yang  sama. Hal  ini  sejalan  dengan  prinsippergerakan molekul  bermuatan,  yakni molekul  bermuatan  dapat  bergerak  bebas  di bawah pengaruh medan  listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji, 1996).



MATERI DAN METODE PRAKTIKUM
Materi Praktikum
2.    Alat dan Bahan Praktikum.
    Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum yaitu :
•    Mikro pipet
•    Mesin vortex
•    Mesin sentrifugasi (sentrifius)
•    Tabung ependorf
•    Gloves (sarung tangan)
Adapun bahan - bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :

Larutan I    Larutan II    Larutan III
50 mM glucose    0.2 N NaOH (harus fresh)    5 M potassium acetate 60 ml
25 Mm Tris-CL  (Ph 8.0)    1 % SDS    Acetit acid glacial 11.5 ml
10 Mm EDTA (pH 8.0)        H2O 28.5 ml


Metode Praktikum

Adapun metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :
•    Resusupensikan pellet dengan 100 µl larutan I dingin. Campur merata dengan menggunakan vortex,diulang selama 3x
•    Tambahkan 200µl larutan II.Campur dengan merata dengan cara membolak balik tabung dengan cepat beberapa kali (jangan menggunakan vortez!!!)
•    Tambahkan 150µl larutan III dingin.Vortex selama beberapa detik kemudian balikkan posisi tabung (inverted)selamam 10 detik. Kembalikan tabung keposisi semula dan simpan dalam es selama 3-5 menit.
•    Lakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 5 menit pada suhu 4ºc ,setelah sentrifugasi ,ambil supernatant dan pindahkan ke tabung lain.
•    Tambahkan phenol:chloroform dengan perbandingan volume 1:1 dengan jumlah supernatant yang diperoleh ,misalkan volume supernatant yang diperoleh adalah 300 µl.
•    Campur dengan merata dengan menggunakan vortex kemudian kemudian lakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 2 menit pada suhu 4ºc.
•    Setelah sentrifugasi, ambil supernatant dan pindahkan ke dalam tabung lain.
•    Tambahkan etanol (2x volume supernatant ) untuk memperesipitasikan DNA.Campur dengan vortex, kemudian biarkan pada suhu kamar selama 2 menit.
•    Lakukan sentrifugasi 12,000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºc.
•    Buang supernatant perlahan lahan ,balikkan tabung dan biarkan kering udara selama beberapa menit.
•    Bilas DNA pellet dengan ethanol 70% (dingin) kemudian sentrifugasi seperti cara no 9.
•    Buang supernatant, balikkan tabung dan biarkan kering udara selama 10 menit.
•    Resuspensi DNA dengan 25 µl buffer TE(Ph 8.0)

MATERI DAN METODE
Materi Praktikum
1.     Alat yang digunakan
Alat  yang  digunakan  dalam   elektroforesis  yaitu :
•    Tabung  eppendorf.
•    Mikropipet.
•     mortar.
•    Tabung Erlenmeyer.
•    gelas ukur.
•    Penangas air (dengan suhu 800C).
•    Magnetic  stirrer.
•     Magnetic  bar.
•     Sentrifuga,  pinset.
•    Timbangan.
•     Pompa  vacuum.
•     Cetakan gel 20x16x1 cm3.
•     Timer.
•    Meja pendingin.
•     Pembungkus plastic.
•    Freezer.
•     Kawat halus.
•    Incubator.
•    power  supply.
•    Pisau.
•     penggaris. 
•    Spidol.
•     kantong  plastik  tebal.

2.     Bahan yang digunakan
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :
•    Saparation gel komponen.
•    Acrylamide 30% .
•    4x separation buffer.
•    50% glycerol.
•    Air seteril.
•    10% APS/ammonium persulpat.


Metode Praktikum
Metode praktikum kali ini adalah dengan peragaan oleh dosen tentang alat
yang digunakan untuk elektrolisis dan cara penggunaanya.
•    Siapkan buffer,air seteril.
•    Semua bahan dicampur dalam 1 campuran.
•    Masukkan dalam cetakan.
•    Mengambil bahan dan masukkan dalam vacuum
•    Mengambil 4x separation buffer ,50%glicerol, air seteril
•    Semprotkan dengan pipet kedalam cetakan.
•    Tunggu selama 15 menit baru dimasukkan ke 2.
•    Masukkan lapisan ke 2.
•    Lepas dari penjepit dan ambil sisirnya.
•    Masukkan dalam dump yang berisi buffer.
•    Menyiapkan sampel .
•    Sebelumnya sampel dicampur dalam evendorf kosong , sama 2x sampel buffer tergantung kebutuhan.
•    Dan diruning selama 3 jam dan 10 voult baru dikeluarkan.
•    Pengecetan peronit setelah dari elektroporesis dengan mengkumasi berlian blue cuci dengan cairan methanol,akuades,asam asetat.
Tempat dan Tanggal Praktikum

Tempat Praktikum
    Adapun tempat praktikum Pengantar Bioteknologi dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi dan Mikrobiologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram.
Tanggal Praktikum
    Adapun tanggal dilaksanakan praktikum Pengantar Bioteknologi  ini pada hari Rabu, 23 November 2011.




HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Praktikum
Dari  pengamatan  yang  kami  lakukan,  cara  kerja  metode  elktroforesis adalah sebagai berikut:

1.  Pembuatan gel
Cara  pembuatan  gel  adalah  dengan  melarutkan  gel  bubuk  yang  khusus digunakan  untuk  elktroforesis  pada  erlenmeyer,  kemudian  di  cetak  pada  cetakan khusus yang telah disediakan dan ditunggu hingga kering.  Dalam pembuatan agar, proporsi campuran antara agar dan pelarutnya harus sesuai, karena kalau tidak maka substratnya tidak akan dapat berjalan .

2.  Penempatan sampel
Gel dilepaskan dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan menggunakan  pisau.  Bagian  ujung  gel  diiris  atau  dibuat  sumuran  dengan  cetakan khusus  kira 2 cm dari salah satu tepi yaitu dari arah katoda yang sebagai penyimpan ekstrak  enzim. Ekstar enzim yang  akan diuji dikeluarkan dari  freezer dan dibiarkan sebentar  hingga  mencair.  Pengambilan  ekstrak  enzim  dilakukan  dengan  cara mencelupkan kertas saring berukuran 6 x 15 mm ke ekstrak enzim atau dengan pipt mikro.  Potongan  kertas  saring  yang  telah  berisi  ekstrak  enzim  diletakkan  dengan posisi tegak lurus ke celah irisan gel. Jarak anatra celah 1-1.5 mm. Sebagai indikator adanya pergerakan maka celah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol.

3.  Proses Elektroforesis
Gel  yang  telah  siap  kemudian  diletakkan  secara  horizontal  diatas  kotak elektroforis  yang  telah  berisi  larutan  penyangga  elektroda.  Proses  ini  dilakukan  di
dalam  lemari  pendingin  dengan  suhu  40C.  Kedua  sisi  gel  diberi  spons  yang  telah
dibasahi  dengan  larutan  penyangga  elektroda  sebagai  jembatan  anatar  larutanpenyangga elektroda dengan gel. Setelah itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut  diberi  gel  yang  dingin.  Proses  elekrofororsis  dijalankan  dengan  memberi daya  listrik  pada  gel. Pemberian  daya  listrik  disesuaikan  dengan  sampel  yang  akan digunakan, misalnya sebesar 50-70  A, 50-60  A atau 45-55  A selama kurang lebih 3  jam. Setelah  terlihat bahwa biru brom  fenol mencapai  titik yang berjarak ± 3  cm dari ujung gel, maka proses elekrofororsis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai
dipotong,  sedangkan  potongan  gel  yang  menjadi  tempat migrasi  enzim  diiris  tipis secara  horizontal  dengan  menggunakan  gergaji  yang  berkawat  tipis.  Gel  diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar gel yang diletakkan dalam wadah plastik, untuk selanjutnya diwarnai sesuia enzim yang akan dianalisis.

4.  Visualisasi sistem enzim
Visualisasi  sistem  dilakukan  dengan  pewarna  biokimia.  Dengan  komposisi yang telah ditentukan sebelumnya. Atau dapat pula dilakukan dengan pancaran sinar Ultraviolet.

6. Metode Analisis
Dalam hal  ini cara menganalisa hasil pita dari elektroforosis  tersebut  sangat tergantung dari topik apa yang akan diteliti. Hasil visualisasi enzim berupa binti atau noda yang disebut pola pita  (bandmorp). Macam pola pita dibedakan  atas  tipe pola pita  yang  terbentuk.  Semua  tipe  pola  pita  yang  terbentuk  diinterpretasikan  sebagai lokus  isozim  dan  alel  yang  kemudian  dijadikan  dasar  dalam  pengukuran  parameter yanga da dalam suatu populasi. 



KESIMPULAN DAN SARAN

1. Kesimpulan 
Elektroforesis  merupakan  proses  bergeraknya  molekul  bermuatan  pada suatu  medan  listrik.  Kecepatan  molekul  yang  bergerak  pada  medan  listrik tergantung  pada  muatan,  bentuk  dan  ukuran.  Dengan  demikian  elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang  terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,  ataupun  dilakukan  kuantifikasi  dengan  densitometer.
Elektroforesis  untuk  makromolekul  memerlukan  matriks  penyangga  untuk mencegah  terjadinya  difusi  karena  timbulnya  panas  dari  arus  listrik  yang digunakan.  Gel  poliakrilamid  dan  agarosa  merupakan  matriks  penyangga  yang banyak  dipakai  untuk  separasi  protein  dan  asam  nukleat.  Elektroforesis  yang dibahas di bawah  ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida  (PAGE = polyacrilamida  gel  electrophoresis)  untuk  separasi  sampel  protein.  Banyak molekul  biologi  bermuatan  listrik  yang  besarnya  tergantung  pada  pH  dan komposisi medium  dimana molekul  biologi  tersebut  terlarut. Bila  berada  dalam suatu  medan  listrik,  molekul  biologi  yang  bermuatan  positif  akan  bermigrasi keelektroda  negatif  dan  sebaliknya.  Prinsip  inilah  yang  dipakai  dalam  elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul berdasarkan muatannya. 
Cara kerja menggunakan metode elktroforesis adalah: 1) Ektraksi enzim, 2) Pembuatan gel, 3) Penempatan sampel, 4) Proses Elektroforesis, 5) Visualisasi sistem enzim dan 6) Metode Analisis. 

2. Saran 
Saran pada praaktikum kali ini adalah sebaiknya praktikum dilakukan oleh praktikan  sendiri  dan  dilkukan  proses  elektroforesis  yang  sebenarnya  supaya praktikan lebih mengetahi cara menggunakan metode elektroforesis.



DAFTAR PUSTAKA

Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1.
                  Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta

Sudarmadji,  S.,  1996.  Teknik  Analisa  Biokimiawi.  Edisi  Pertama.Liberty.
                 Yogyakarta.

Sumitro,  S.  B,  Fatchiyah,  Rahayu,  Widyarti,  dan  Arumningtyas.  1996.  Kursus
     Teknik-Teknik  Dasar  Analisis  Protein  dan  DNA.  Jurusan  Biologi  FMIPA
                 Universitas Brawijaya. Malang

Zubay,  G.  L.  1989.  Biochemistry  2nd  Edition. Mcmillan  Publishing     Coorporation. New York

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar